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染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗方案

發(fā)布于 2023-08-21


染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)是一種研究蛋白質(zhì)與染色質(zhì)DNA相互作用的技術(shù),根據(jù)不同目的既可用于鑒定互作蛋白,也可用于鑒定互作DNA。通常被用于表觀遺傳學研究,如通過ChIP檢測轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的組蛋白修飾。

操作步驟:

一、 樣品準備(操作樣品在冰上或4℃進行。)

對于懸浮細胞, 確保10 ml新鮮培養(yǎng)基中有合適數(shù)量的細胞,直接加37%甲醛至終濃度為1%。搖晃混勻后,室溫下?lián)u床孵育10 min。
對于組織, 液氮充分研磨組織至粉末狀。然后轉(zhuǎn)移至15 ml或50 ml尖底管中,加入10 ml PBS(Cat No. PR20023)和 270 μl 37%甲醛至終濃度為1%。搖晃混勻后,室溫下?lián)u床孵育10 min。
加入500 ul 2.5 M甘氨酸(至終濃度0.125 M)終止反應(yīng),室溫孵育5 min。

細胞轉(zhuǎn)至50 ml尖底管中,4℃、2500 rpm離心5 min。

棄上清,冰預(yù)冷PBS(pH 7.4)洗滌細胞2次,每次洗滌后4℃、2500 rpm離心5 min。

用1 ml冰預(yù)冷細胞裂解液(Cat No. PR20001,現(xiàn)加蛋白酶抑制劑(Cat No. PR20016)),重懸細胞。為促進細胞膜的破裂,用Douncer玻璃勻漿器勻漿細胞5~10次,4℃孵育15 min。

4℃、4000 rpm離心5 min,棄上清。

細胞裂解液重新細胞核 (每3-5 x 106 個細胞加100 ul裂解液)。

冰上超聲5~15 min(25%功率,超聲20s、停30s),最佳超聲條件需要根據(jù)預(yù)實驗確定。

4℃、12000 rpm離心5 min,轉(zhuǎn)移上清至新EP管中,直接進行后續(xù)試驗,或凍存-20℃?zhèn)溆谩?br />
二、DNA斷裂效果檢測

取50 ul染色質(zhì)上清,加入150 ul ddH2O,10 ul 5M NaCl,65 ℃ 4 h或過夜,解交聯(lián)。

加入RNaseA至終濃度50 μg/ml,37 ℃孵育30 min。

加入Proteinase K至終濃度50 μg/ml,42 ℃孵育30 min。

劑盒純化DNA片段。

1.5 %瓊脂糖膠電泳檢測。

三、免疫沉淀(按單個CHIP反應(yīng))

準備70 ul磁珠。

用600 μl含5 %BSA的PBS,洗滌磁珠2次。

第二次洗滌后,重懸磁珠至初始體積。

取100 ul細胞裂解物(約含20 ug 染色質(zhì),具體因細胞及制樣不同而異),1:10稀釋至1 ml。

取25 ul洗好的磁珠,加至細胞裂解物中,進行l(wèi)ysate 預(yù)吸附處理。

剩余45 ul磁珠,加入2-5 ug相應(yīng)抗體,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。(使用非特異性的IgG,作為陰性抗體對照)。

將步驟5 中樣品,磁性分離,轉(zhuǎn)移預(yù)吸附后的lysate至新EP管中。

用300 ul 冰預(yù)冷的 PBS(含5% BSA),洗滌步驟6后的抗體-磁珠復(fù)合物2次,棄上清。

加入預(yù)吸附后的lysate(留50 ul凍存?zhèn)溆茫┲量贵w-磁珠復(fù)合物中,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育2 h。

瞬離樣品,然后置于磁力架上。

每次1 ml低鹽洗滌液,洗滌2次。

每次1 ml高鹽洗滌液,洗滌2次。

每次1 ml LiCl洗滌液,洗滌2次。

每次1 ml TE溶液,洗滌2次。第2次洗滌時,轉(zhuǎn)移樣品至新EP管中。

最后洗滌結(jié)束,移液器盡棄洗滌液。

準備Elution buffer,恒溫浴調(diào)至65 ℃。

加入100 ul Elution buffer至每個樣品中(步驟15后),65 ℃孵育10 min。

轉(zhuǎn)移洗脫液至新EP管,并重復(fù)步驟17一次,最終收集到200 ul。

取之前預(yù)吸附后的lysate 50 ul,作為 5% Input。補加150 ul Elution buffer,至總體積200 ul。

分別向CHIP洗脫樣品(步驟18后)和Input中加入10 ul NaCl(5 M 母液),65 ℃孵育過夜進行解交聯(lián)。

四、DNA純化和分析:

加入Proteinase K至終濃度50 μg/ml,42 ℃孵育1 h。

試劑盒純化DNA片段。

PCR檢測及分析。

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